16 Мар Влияние скорости понижения температуры на биологические объекты
Влияние скорости понижения температуры на биологические объекты
В зависимости от скорости понижения температуры объекта охлаждение бывает медленным, быстрым и сверхбыстрым (таблица 1).
| Охлаждение | Продолжительность | Скорость понижения температуры |
| Очень медленное | Несколько часов | Не более 10 °С в 1 ч |
| Медленное | 1 ч – 10 мин | От 10 °С в 1 ч до 10 °С в 1 мин |
| Быстрое | 10 мин – 1 мин | От 10 до 60 °С в 1 мин |
| Очень быстрое | 60 с – 10 с | От 100 °С в 1 мин до 100 °С в 1 с |
| Сверхбыстрое | Менее 5 с | Свыше 100 °С в 1 с |
Опытные наблюдения свидетельствуют о том, что многие органические вещества и некоторые биологические объекты лучше сохраняются при быстром и сверхбыстром замораживании. Например, диски концентрированного желатинового геля, быстро замороженные в жидком воздухе, не изменяются в результате кристаллообразования, а также под действием повреждающих факторов. Яичный желток утрачивает биологическую активность после замораживания до –6 °С, но не повреждается при замораживании в жидком азоте и быстром оттаивании в теплой ртути.
В ряде случаев активность ферментов сохраняется в значительной степени при быстром или сверхбыстром замораживании. В живых клетках при медленном понижении температуры могут возникать катаболические реакции, приводящие к образованию токсичных продуктов. При быстром охлаждении остается меньше времени для воздействия солевых растворов на структуры белка. Микроскопические исследования биологических объектов также показали, что их структура сохраняется тем лучше, чем быстрее проводится замораживание. Положительные результаты сверхбыстрого замораживания микроскопических по размеру живых объектов послужили подтверждением преимущества высоких скоростей замораживания.
Сохранение жизнеспособности некоторых биологических объектов при их сверхбыстром замораживании обусловлено витрификацией (стеклообразованием) воды в протоплазме клеток и последующей девитрификацией (расстеклованием) при быстром отеплении. Действительно, при витрификации и девитрификации протоплазмы не происходит перегруппировки молекул воды, что способствует сохранению тонкой структуры протоплазмы клеток.
Витрификация представляет собой глубокое переохлаждение жидкости, в которой отсутствует кристаллическая решетка. Затвердеванию жидкости в аморфном, стеклообразном состоянии способствует увеличение ее вязкости при понижении температуры, которое затрудняет перегруппировку молекул в кристаллические структуры. Для биологических объектов обязательными условиями витрификации ранее считали их предварительное частичное обезвоживание в концентрированных растворах защитных веществ, приводящее к повышению вязкости протоплазмы, и высокую, порядка нескольких сот градусов в секунду, скорость охлаждения.
Исследования биологических объектов с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа показали, что при охлаждении с максимально доступной скоростью они всегда содержат наряду с аморфной массой затвердевшей жидкости мельчайшие кристаллы льда.
Многочисленная группа объектов животного происхождения не переносит быстрого и сверхбыстрого охлаждения. Такой характер реакции на скорость охлаждения обусловливается различной чувствительностью биологических объектов к повреждающим факторам температурного шока и продолжительности воздействия концентрированных солевых растворов. Объекты, требующие медленного понижения температуры, относительно устойчивы к повышенным концентрациям электролитов, но очень чувствительны к температурному шоку.
Экспериментально установлено, что жизнеспособность клеток и тканей при их глубоком охлаждении можно сохранить путем ступенчатого замораживания: сначала медленно до температуры –30 °С, а затем быстро до более низких.
Вследствие использования защитных веществ при замораживании реакция биологического объекта на скорость охлаждения изменяется и становится возможным применять очень высокие скорости замораживания. Например, кожная ткань в 12 – 17%–ном растворе глицерина сохраняет жизнеспособность при любых комбинациях замораживания и оттаивании, что свидетельствует о ее очень высокой устойчивости к низким температурам. Хорошие результаты получены при замораживании эритроцитов в 25 – 30 %–ном растворе глицерина и медленном замораживании до –79 °С. После этого возможно быстрое охлаждение до –196 °С. Для консервирования клеток костного мозга также рекомендуется двухстадийное охлаждение: от 0 до –15 °С со скоростью 1 °С в 1 мин, а затем до –196 °С со скоростью 400 – 600 °С в 1 мин. В качестве защитных веществ используются глицерин, поливинилпирролидон и полиэтиленоксид.
В ряде случаев активность ферментов сохраняется в значительной степени при быстром или сверхбыстром замораживании. В живых клетках при медленном понижении температуры могут возникать катаболические реакции, приводящие к образованию токсичных продуктов. При быстром охлаждении остается меньше времени для воздействия солевых растворов на структуры белка. Микроскопические исследования биологических объектов также показали, что их структура сохраняется тем лучше, чем быстрее проводится замораживание. Положительные результаты сверхбыстрого замораживания микроскопических по размеру живых объектов послужили подтверждением преимущества высоких скоростей замораживания.
Сохранение жизнеспособности некоторых биологических объектов при их сверхбыстром замораживании обусловлено витрификацией (стеклообразованием) воды в протоплазме клеток и последующей девитрификацией (расстеклованием) при быстром отеплении. Действительно, при витрификации и девитрификации протоплазмы не происходит перегруппировки молекул воды, что способствует сохранению тонкой структуры протоплазмы клеток.
Витрификация представляет собой глубокое переохлаждение жидкости, в которой отсутствует кристаллическая решетка. Затвердеванию жидкости в аморфном, стеклообразном состоянии способствует увеличение ее вязкости при понижении температуры, которое затрудняет перегруппировку молекул в кристаллические структуры. Для биологических объектов обязательными условиями витрификации ранее считали их предварительное частичное обезвоживание в концентрированных растворах защитных веществ, приводящее к повышению вязкости протоплазмы, и высокую, порядка нескольких сот градусов в секунду, скорость охлаждения.
Исследования биологических объектов с помощью электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа показали, что при охлаждении с максимально доступной скоростью они всегда содержат наряду с аморфной массой затвердевшей жидкости мельчайшие кристаллы льда.
Многочисленная группа объектов животного происхождения не переносит быстрого и сверхбыстрого охлаждения. Такой характер реакции на скорость охлаждения обусловливается различной чувствительностью биологических объектов к повреждающим факторам температурного шока и продолжительности воздействия концентрированных солевых растворов. Объекты, требующие медленного понижения температуры, относительно устойчивы к повышенным концентрациям электролитов, но очень чувствительны к температурному шоку.
Экспериментально установлено, что жизнеспособность клеток и тканей при их глубоком охлаждении можно сохранить путем ступенчатого замораживания: сначала медленно до температуры –30 °С, а затем быстро до более низких.
Вследствие использования защитных веществ при замораживании реакция биологического объекта на скорость охлаждения изменяется и становится возможным применять очень высокие скорости замораживания. Например, кожная ткань в 12 – 17%–ном растворе глицерина сохраняет жизнеспособность при любых комбинациях замораживания и оттаивании, что свидетельствует о ее очень высокой устойчивости к низким температурам. Хорошие результаты получены при замораживании эритроцитов в 25 – 30 %–ном растворе глицерина и медленном замораживании до –79 °С. После этого возможно быстрое охлаждение до –196 °С. Для консервирования клеток костного мозга также рекомендуется двухстадийное охлаждение: от 0 до –15 °С со скоростью 1 °С в 1 мин, а затем до –196 °С со скоростью 400 – 600 °С в 1 мин. В качестве защитных веществ используются глицерин, поливинилпирролидон и полиэтиленоксид.